Enzyme calculator for most optimal KEX 2 proteolysis.

Mabion S.A. provides a calculator which calculates the ideal amount of enzyme needed during KEX 2 proteolysis.

Podane wartości zakładają, że trawiony peptyd ma struktrę liniową. Przy istnieniu skomplikowanych struktur III-rzędowych, trawienie może być utrudnione. W przypadku rozbudowanych struktur białkowych w pierwszej kolejności peptydaza przetnie miejsca liniowe w białku. Aby sprawdzić strukture swojego peptydu skorzystaj z symulatora na stronie: https://www.proteinmodelportal.org/

Celem niniejszego projektu była innowacyjna technologia double cutting pozwalajaca na uzyskiwanie analogów hormonu insuliny przy użyciu dwóch proteaz: enterokinazy i endoproteinzay Asp-N, których aktywności proteolityczne zasadniczo różnią się od tych, którymi charakteryzują się trypsyna i karboksypeptydaza C.

Technologia otrzymywania insuliny lub jej analogu z zastosowaniem innowacyjnego rozwiązania opracowanego przez firmę Mabion i będącego przedmiotem zgłoszenia patentowego, rozpoczyna się produkcją prekursora, zawierającego sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez enterokinazę oraz sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez endoproteinazę Asp-N. Do ekspresji białka rekombinowanego stosuje się bakteryjnego gospodarza Escherichia coli szczep BL21, a proces fermentacji przeprowadza się w zoptymalizowanych warunkach, zapewniających wydajną produkcję prekursora. Osad bakteryjny, zawierający rekombinowane białko przechodzi kilkustopniową obróbkę, mającą na celu uzyskanie frakcji lizatu białek do etapu oczyszczania, poprzez mechaniczne uszkodzenie komórek oraz ich lizę. Następująca po tym sekwencja oczyszczania prekursora to dwuetapowy proces chromatografii powinowactwa (jeśli zawiera sekwencję np. His-tag) lub jonowymienna. Wreszcie otrzymane, czyste białko prekursora poddaje się działaniu kolejno pierwszej proteazy, enterokinazy i drugiej proteazy, endopeptydazy Asp-N. Finalnie insulina lub jej analog jest izolowany z mieszaniny reakcyjnej na drodze rozdziału chromatograficznego.

Zaproponowana przez Mabion S.A. innowacja procesowa w znaczący sposób, zgodnie z przyjętymi założeniami, może wpłynąć na cykl produkcyjny poprzez zwiększenie wydajności wytwarzania analogów insuliny w stosunku do klasycznej technologii wytwarzania produktów biotechnologicznych, poprawę parametrów jakościowych wytwarzanego produktu jak również przyspieszy proces wytwarzania produktu gotowego.

Zastosowanie innowacyjnego procesu technologicznego w porównaniu z klasyczną technologią wytwarzania analogów insuliny umożliwia obniżenie kosztów produkcji leku poprzez:

  1. możliwość uzyskiwania insuliny ludzkiej i innych analogów w procesie opartym o pojedynczą kulturę komórkową, a następnie oczyszczanie rekombinowanego białka w pojedynczym procesie chromatograficznym;
  2. unikanie powstawania pochodnych insuliny jako zanieczyszczeń podczas uzyskiwania insulin powstających podczas tradycyjnej obróbki enzymatycznej z wykorzystaniem trypsyny;
  3. unikanie pochodnych insuliny jako zanieczyszczeń podczas uzyskiwania analogów insulin powstających podczas tradycyjnej, nie do końca specyficznej, obróbki enzymatycznej z wykorzystaniem trypsyny;
  4. możliwość uzyskiwania analogów posiadających dodatkowe aminokwasy, w tym zasadowe na końcach łańcuchów A i B bez dodatkowej syntezy chemicznej;
  5. możliwość odcięcia metioniny i ewentualnych peptydów fuzyjnych równocześnie z odcięciem peptydu C proinsuliny, lub innych peptydów oddzielających łańcuchy A i B.

Podane wartości zakładają, że trawiony peptyd ma struktrę liniową. Przy istnieniu skomplikowanych struktur III-rzędowych, trawienie może być utrudnione. W przypadku rozbudowanych struktur białkowych w pierwszej kolejności peptydaza przetnie miejsca liniowe w białku. Aby sprawdzić strukture swojego peptydu skorzystaj z symulatora na stronie: https://www.proteinmodelportal.org/